GUIA No.3

GUIA DE TRABAJO INDEPENDIENTE No.3

ENCUENTRO ACADEMICO:          CUARTO - SEXTA - SEPTIMA 
TIEMPO PRESENCIAL:                  6 HORAS
TIEMPO INDEPENDIENTE: 

UNIDAD TEMATICA:                       Fisiología bacteriana y propiedades genéticas 
LABORATORIO No.2:          “Metodología para el aislamiento y Evidencias del Metabolismo bacteriano”.

 I. COMPETENCIA.

Con la utilización de los implementos, reactivos adecuados y el desarrollo de la práctica el Estudiante de Microbiología: 
  • Conceptualiza las necesidades y requerimiento nutricionales para el desarrollo adecuado de los microorganismos.
  • Enumera los factores físicos que interactúan para el desarrollo optimo de los microorganismos. 
  • Describe la información teóricamente sobre las clases y composición de los medios de cultivo bacteriológicos.
  • Conceptualiza la manera técnica para la preparación y presentación de los medios de cultivo bacteriano. 
  • Asocia las necesidades nutricionales de los microorganismos y la utilidad de los medios de cultivo para establecer condiciones optimas de reproducción y desarrollo. 
  • Tiene habilidad con las técnicas básicas para el aislamiento microbiano sobre medio de cultivo bacteriológico sólido, semisólido o liquido. 
  • Aplica la técnica de siembra por agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas y hacer posible su identificación. 
  • Analiza las principales características de desarrollo de las bacterias en los diferentes medios de cultivo y relaciona los cambios que ocurren con la actividad metabólica que presentan las bacterias en estudio. 
  • Aplica las normas de bioseguridad requeridas para el caso del trabajo con bacterias y medios de cultivos.

II. CONCEPTUALIZACION.

Las células están constituidas por material orgánico e inorgánico. En los microorganismos, la mayor parte del peso seco consiste en materia orgánica formada de macromoléculas que contiene los elementos: carbono, hidrogeno, nitrógeno, oxigeno, fósforo y azufre. El material inorgánico esta conformado por elementos como sodio, potasio, hierro, calcio, magnesio, cloruros, etc., que facilitan una serie ordenada de reacciones bioquímicas que tiene por objetivo final la producción y consumo de energía.

 Para que una bacteria viva se desarrolle y reproduzca se requiere que todos los elementos de su materia orgánica y el complemento total de iones (requerimiento nutricional) necesarios para la energética y catálisis estén presentes en concentraciones optimas y el ambiente (condiciones físicas) tanto intracelular como extracelular favorezcan las reacciones bioquímicas, pues ella, debe de ser capaz de efectuar un gran numero de cambios químicos en las moléculas del medio en que vive antes de que entren a la célula, y hacer cambios adicionales una vez que estos penetren a la misma. Algunos de los materiales son asimilados y forman parte de la célula mientras que otros son descompuestos para obtener energía. Al proceso anteriormente descrito se denomina METABOLISMO.

 El metabolismo, trae como consecuencia el crecimiento de un organismo (por lo tanto, en bacterias, que conduce a la creación de nuevas células). El metabolismo de la bacteria comprende dos grandes tipos de reacciones:

 1. Reacciones de catabolismo (destrucción) o suministro de energía para las actividades vitales propias de una célula procariótica. Esta puede ser obtenida a partir de una variedad de ambientes químicos extracelulares acoplados a mecanismos como:

  • Fosforilación a nivel del sustrato (glucólisis, Ciclo de Krebs, Ciclo de las pentosas, y fermentaciones)
  • Fosforilación oxidativa. (cadena respiratoria)
  • Foto-fosforilación ó producción de energía por fotosíntesis.

 2. Reacciones del anabolismo (biosíntesis), que usan energía y poder reductor procedente de las reacciones de suministro. Las bacterias requieren aporte continuo y de acceso inmediato de energía, que es usada en procesos de síntesis de macromoléculas (Nucleótidos, proteínas, pared bacteriana), Transporte de nutrientes (transporte activo translocación de proteínas a través de la membrana citoplasmática), movimiento flagelar, producción de calor etc.

 Este proceso de acoplamiento y transferencia de energía entre las reacciones catabólicas y anabólicas se hace a través de la molécula de ATP. La moneda energética de la célula.

 Para poder disponer de los ATPs, los seres vivos han de captar alguna fuente de energía externa del medio ambiente. Para el caso de las bacterias ó células procariotas se tiene:

 a. Bacterias Fototrofas. Si la fuente de energía externa del medio ambiente procede de radiaciones (en los cuantos de una determinada longitud de onda de la luz visible). Estas a su vez pueden ser:
  • Fotolitotrofas: captan energía lumínica en presencia de sustancias inorgánicas. 
  • Fotoorganotrofas: captan energía lumínica con requerimiento de sustancias orgánicas.
b. Bacterias Quimiotrofas. Si la energía se desprende a partir de moléculas químicas en reacciones biológicas de óxido-reducción; a su vez pueden ser:
  • Quimiolitotrofas: captación de energía química a partir de sustancias inorgánicas;
  • Quimiorganotrofas: captación de energía química a partir de sustancias orgánicas
En los organismos quimiotrofos, la captación de energía consiste esencialmente en la oxidación de un sustrato reducido (orgánico en quimiorganotrofos e inorgánico en quimiolitotrofos) con una reducción concomitante de un aceptor de electrones (que a su vez puede ser orgánico o inorgánico), y todo ello acoplado a un sistema de fosforilación del ADP, que se convierte en ATP.

 Así mismo, la producción de ATPs esta relacionado con el aceptor final para los electrones extraídos del material orgánico o inorgánico; en relación a esto se tiene:
  • La Respiración Aerobia donde el oxígeno molecular se usa como sumidero de los electrones procedentes de la cadena transportadora, y junto con protones se reduce hasta agua.
  • La Respiración Anaerobia, en algunas bacterias, al final de la cadena transporte de electrones puede existir un aceptor diferente del oxígeno. 
Como se menciona con anterioridad, la producción energética por parte de los microorganismos tiene como exigencia la presencia un componente ambiental y un componente nutricional en concentraciones optimas tanto intracelular como extracelular para favorecer las reacciones bioquímicas y promover el crecimiento de la bacteria. En la actualidad, para estudio de la fisiología bacteriana, se cuenta con una herramienta, los medios de cultivo microbiológicos, que poseen los requerimientos nutricionales mínimos de acuerdo a las necesidades nutricionales y son brindados de una forma accesible a los microorganismos.

 La presentación comercial de los medios de cultivo microbiológicos (granulada ó polvo) y los tipos de medios de cultivo (enriquecidos, selectivos, diferenciales, etc.) permite con moderada técnica obtener y regular un sistema de desarrollo microbiológico que dando por estabilizar los factores ó necesidades físicos para el desarrollo (temperatura, pH, necesidad de gases, etc.).

 Tipos de Medios de Cultivo.

 Los medios de cultivo son un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el crecimiento y desarrollo de muchas bacterias heterótrofas 

 Algunos heterótrofos tienen requerimientos nutricionales muy elaborados para nutrientes específicos (p.e las vitaminas, factores de crecimiento, etc.); además se requieren medios de cultivo con propósitos especiales (p.e identificación, aislamiento, cuantificación, etc.,). Esto hace una gran variedad de medios que se puedan agrupar de acuerdo a diferentes criterios. Se les puede Clasificar de la siguiente manera:

 a) Naturaleza.
  • Naturales: son medios de cultivo que contienen nutrientes que no han sido modificados o alterados químicamente. Por ejemplo una rebanada de pan, leche desnatada, etc. 
  • Sintéticos: son medios de cultivo cuyos ingredientes han sido purificados o modificados y su composición esta químicamente definida. Por ejemplo caldo nutritivo, Agar Mac Conkey, etc. 
b) Consistencia.
  • Sólidos: En la composición de estos medios, hay la presencia de una sustancia solidificante llamada Agar Agar en proporción variable del 1 al 2%.
  • Semisólidos: La presencia del componente Agar Agar esta en cantidades pequeñas (0,5% ó menos), impartiéndose una consistencia de natilla. 
  • Líquidos: La característica principal de estos medios es la ausencia de la sustancia solidificante (Agar Agar).

 c) Aplicación.
  • Enriquecidos: en estos medios de cultivo crecen todos los microorganismos ya que en su composición nutricional, la adición de sustancias especiales (p.e sangre, suero, tejidos, etc.) le proporciona al medio complemento nutricional para que pueda soportar el crecimiento de organismos heterótrofos exigentes. Ejemplo, Agar Sangre, agar Yema de huevo. Etc. 
  • Selectivos: en estos medios la adición de ciertas sustancias química especificas, no permitirá el desarrollo de un grupo de bacterias, sin inhibir al mismo tiempo el crecimiento de otros grupos. Son ejemplo, Agar EMB, Agar S-S
  • Diferenciales: La adición de ciertos reactivos o sustancias químicas a los medios de cultivo trae como resultado determinado tipo crecimiento bacteriano o cambios, después de la siembre e incubación del medio, lo cual permite al observador diferenciar distintos grupo de bacterias. Son ejemplo, Agar MacConkey, TSI, LIA, etc.
  • De Prueba: se utilizan para realizar ensayo de vitaminas, aminoácidos y antibióticos. Tienen una composición conocida. Ejemplo, Agar Muller Hinton (Antibióticos).
  • Mantenimiento ó Transporte: Se utilizan para preservar satisfactoriamente las características fisiológicas y viabilidad de un cultivo. Ejemplo, Clary Blair.
  • Caracterización: Para determinar el tipo de crecimiento producido por los organismos, asi como la capacidad de estos para producir cambios químicos. Ejemplo, TSI, LIA, SIM, Citrato de Simmon´s, etc. 

Necesidades físicas para el desarrollo bacteriano.

a) Temperatura:

El desarrollo bacteriano (velocidad de crecimiento y desarrollo total de la bacteria) depende de las reacciones bioquímicas y de la velocidad con que se efectúen estas reacciones, las variaciones de la temperatura influyen en los procesos metabólicos y la morfología celular. 

 Cada especie crece a temperatura optima y de acuerdo a esto se puede dividir en los siguiente grupos:
  • Psicrófilas: crecen óptimamente 15 – 20ºC; pero capaces de desarrollarse a 0ºC ó menos.
  • Mesófilas: crecen mejor en limites de 25 – 40ºCó
  • Termófilas: crecen entre 45 – 60ºC de forma satisfactoria. 
b) Ambiente gaseoso: 

Los principales gases que afectan el desarrollo bacteriano son el oxigeno y el dióxido de carbono presentando una respuesta amplia y variable. Sobre esta base de dividen en:
  • Aerobias / Oxigenicas: bacteria que se desarrollan en presencia de oxigeno libre.
  • Anaerobias / Anoxigenicas: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxigeno libre.
  • Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de oxigeno libre.
  • Microaerofilicas: bacterias que crecen en pequeñísimas cantidades de oxigeno libre.
c) pH.: 

El rango optimo de crecimiento esta entre 6,5 – 7,5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse en valores extremos. Los limites mínimos y máximos corresponden entre pH 4 y 9.

 En estas condiciones, cuando los microorganismos se siembran en un medio y condiciones adecuados, ocurre un incremento muy marcado en el número de células que implica la transición por una serie de fases ó etapas que contemplan características propias y varían de acuerdo a la especie de microorganismo. El procedimiento más común en el ciclo de incremento de las poblaciones bacterianas, es la fisión binaria transversa, en la cual una célula se divide en dos células hijas (reproducción de tipo asexual).

Fases del desarrollo bacteriano.

La duplicación de la población bacteriana a través de la fisión binaria requerirá de un intervalo de tiempo (tiempo de generación) que no es el mismo bajo todos las condiciones y que dependerá del aporte de nutrientes y condiciones físicas de desarrollo. El incremento cuantificable de la población bacteriana responde a una progresión geométrica.

 En la grafica se muestra la curva típica del desarrollo bacteriano en los medios de cultivo bacteriológicos, dado por las siguientes fases:

                            

1.-  Fase de retardo o adaptación
La población permanece temporalmente inalterada, la célula bacteriana incrementa su tamaño, hay actividad metabólica y un retardo en la división celular.

2.-  Fase de crecimiento exponencial o logaritmico
Las células bacterianas se duplican regularmente a ritmo constante, hay uniformidad en composición química, actividad metabólica y fisiológica. En condiciones apropiadas el grado de desarrollo es máximo,

3.-  Fase estacionaria o latencia
Es una tendencia al cese del desarrollo posiblemente al agotamiento de nutrientes, producción de sustancias toxicas. No hay división celular.

4.-  Fase de Declinación ó muerte
El número de células viables desciende geométricamente por una gran variedad de condiciones que contribuyen a la muerte bacteriana (agotamiento de sustancias nutritivas, acumulación de ácidos, etc.). 

Finalmente, el desarrollo ó magnitud de la población se puede determinar por muchas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida:

a) Cuenta celular directa al microscopio, un contador electrónico de particular ó por la cuenta de colonias.

b) Masa celular, pesando o midiendo el contenido celular de nitrógeno ó por turbidimetria. 

c) Actividad Metabólica. Relacionando la actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana.

 III. ESTRATEGIAS METODOLÓGICAS.
  • Película: “Preparación de medios de cultivo Bacteriológicos.
  • Exposición Teórica por parte de los alumnos y acompañamiento del docente.
  • Realización de laboratorio No.3: “Metodología para el aislamiento y Evidencia del Metabolismo bacteriano”. Informe.
  • Elaboración de Informes.

IV. LECTURA DE AVANZADA.

Publicación de cada unidad temática: Tema No.5: Fisiología Bacteriana. Tema No.6: Genética Bacteriana. Por Prof. Cristóbal Zambrano Parada.

 V. EVALUACIÓN.

Con el objeto de orientar y mejorar el proceso educativo, el participante tendrá la presentación de los siguientes elementos: 
  • Resumen, tomando como base la publicación de las unidades temáticas No.5 Fisiología Bacteriana y Tema No.6. Genética Bacteriana:
El grupo de trabajo formado, realizara un resumen que enviaran al correo de la asignatura. La fecha límite de entrega será de 6 días contados a partir de la presentación de la guía de trabajo.
  • Película.
Se presenta el enlace para la comprensión del tema de medios de cultivo.

  • Película.
Se presenta el enlace punto de partida para la realización del Laboratorio No.2 “Metodología para el aislamiento y evidencias del metabolismo bacteriano”.
  • Exposición Teórica por parte del docente.
Con el objeto de definir bases conceptuales, El docente realizará la parte explicativa del tema.

Los participantes realizaran la actividad de laboratorio el cual genera un informe que cumplirá con los requisitos de elaboración y se enviara al correo de la asignatura. Tiempo de recepción máximo seis días después de terminada la practica

VI. BIBLIOGRAFIA.

PELCZAR, Michael J. y Otros. Microbiología. Editorial Mc. Graw Hill. México.1995 (Texto Guía)

BROCK, T.D. Microbiología. Prentice Hall. New Cork. 1990 

FREEMAN A. Bob y Otros. Tratado de Microbiología de Burrows. Editorial Interamericana. México.

JAWETZ, Ernest y Otros. Manual de Microbiología Médica. Editorial Manual Moderno. México.

KONEMAN, E. et Al. Diagnóstico Microbiologico. Editorial Panamerica. 1991

CHALELA, G. Principios de Microbiología. UIS Publicaciones. 1988 

DIAZ, Ramón y Otros. Manual Practico de Microbiología. Editorial Masson S.A. España.

VII. ENLACES DE INTERES.

Metabolismo Bacteriano





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